CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理、方法及注意事項

一、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

用途：**篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

CCK8的優點：
使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；
CCK-8法能快速檢測；
CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；
CCK-8法的重復性優于MTT法；
CCK-8法對細胞毒性小；
CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
 CCK8的缺點：
與MTT法相 比，CCK8和XTT的價格比較貴。
CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。
 
與以往的增殖/毒性測定試劑相比較：

二、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法
實驗一：細胞增殖分析
1、制備細胞懸液：細胞計數
2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基，以換液的形式加入。
5、培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認*佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析
1、制備細胞懸液：細胞計數
2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入不同濃度的毒性物質
5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。
7、培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認*佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

注：
若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。
如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉**影響。當然**影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入**后的空白吸收即可。

三、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項
當使用標準96孔板時，貼壁細胞的*小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。
酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免**污染，以免影響結果。
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。
當在培養箱內培養時，培養板*外一圈的孔*容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，*外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。
在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮**的吸收，可在加入**的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。
懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。